3B biyo-yazıcı ile yapay deri: Hayvan deneylerine alternatif

Geleneksel tıp araştırmalarında, yeni tedavilerin güvenliği, etkinliği çoğunlukla deney hayvanları üzerine yapılan çalışmalar ile belirlenmektedir. Ancak, bu yöntem birçok etik tartışmayı da yol açmaktadır. Aynı zamanda deney hayvanları insan biyolojisini tam olarak yansıtmayabileceğinden dolayı sonuçların genellenebilirliği konusunda problemler ortaya çıkmaktadır. Günümüzde doku mühendisliği alanında yapılan yenilikler, yapay yollarla üretilen dokuların kullanımına olanak tanıyarak, hayvan deneylerine olan ihtiyacı azaltma yönünde gelecek vaat etmektedir. Doğal dokuların biyolojik özellikleri taklit eden selüloz tabanlı üç boyutlu yapay doku iskelelerin (scaffold) geliştirilmesi ile bu zamana kadar tedavisi pek de mümkün olmayan hastalıklar için yeni umutlar doğuracağı açıktır. Bu tür yenilikler insan biyolojisi için daha benzer sistemler kurarken etik kurallar açısından oluşabilecek sorunların önüne geçerek tıp ve mühendislikte yeni bakış açıları sunmaktadır.¹

Araştırmacılar insan derisinin doğal 3 katmanlı yapısını 3D bioprinting (üç boyutlu biyo yazıcı) ile geliştirdikleri hidrojellere, hücreler entegre ederek yaşam alanı oluşturmalarını optimize etmiştir. Ayrıca hidrojellerin yüksek su tutma kapasiteleri hücrelerin yoğun su ihtiyacını karşılayacak boyuttadır.² Bu bağlamda, hücrelerin entegre edildiği hidrojellerin yapısal bütünlüğünü koruyabilen kendi kendine duran üç boyutlu iskele (scaffold) sistemleri, hücre dışı matriksi (ECM) taklit etme, yapısal destek sağlama, hücre bağlanması, çoğalması ve farklılaşması için biyofiziksel ve biyokimyasal olarak elverişli bir mikroçevre sağlamaktadır. Bu iskelelerin imalatında kullanılan malzemelerin yenilenebilir, biyouyumlu ve ayarlanabilir olma özelliklerine sahip olması gerekmektedir. Bu özelliklere uyan en temel malzemeler selüloz bazlı malzemelerdir. Nanofibrile selüloz (NFC), karboksimetil selüloz (CMC) ve sitrik asit (CA) çeşitli birleşimleri ile doku mühendisliğinde yeni yaklaşımlar sunmaktadır. NFC, bitki türevlidir ve nanometrik yapısı sayesinde mekanik mukavemeti yüksektir. Farklı polimerler ile bağ yapma potansiyelinin fazla olmasından dolayı iskele oluşturmada ideal bir malzemedir. CMC de selüloz türevlidir. Hidrojelerin jelleşmesini kolaylaştırır, arayüzeylerde yapışma gücünü artırır, içeriğindeki karboksil grupları su tutma kapasitesini artırır ve yine içeriğinde bulunan iyonik çapraz bağlar sayesinde iskelenin bütünlüğüne destek olmaktadır. CA, biyouyumlu yapısını korurken doğal bir çapraz bağlayıcı olma özelliğinden kaynaklı iskeledeki polimer zincirler arasında kovalent bağlar oluşturur ve iskelenin stabilitesini artırır. Baskı sırasında bu özellikler sayesinde mekanik dayanıklılık ve biyobozunur özelliklerinin daha kontrollü olmasını sağlar. NFC-CMC-CA sistemleri biyouyumluluğu kullanılarak hücrelerin yüzeye tutunmasını kolaylaştırırken değiştirilen özellikleri ile de istenilen şekilde şekillenmesi ile gerekli cilt, kıkırdak, kemik gibi dokularda kullanılmasına imkan sağlamaktadır.¹ Bu avantajlı yönlere rağmen malzemelerin birbiri ile çapraz bağlanması hakkında problemler tam olarak çözülememiştir. Bu durum geliştirilmeye açık bir alandır.

İskelenin 3D bioprinting ile basılabilmesi için ilk olarak iyi bir kesme, inceltme özellikleri barındıran homojen bir mürekkebe ihtiyaç duyulmaktadır.¹ CA, CMC ve NFC sırası ile birbiri içerisinde homojen olacak şekilde karıştırılmıştır ve 2°C–8°C’de sonraki kullanıma kadar muhafaza edilmiştir. Bu işlemde NFC’nin özellikle homojen olarak yayılması gerekmektedir. Aksi takdirde mürekkebin extrüzyon işlemi sırasında nozulun (metal veya plastik) tıkanmasına sebebiyet verebilmektedir.¹ Ayrıca iyi bir baskı performansı ve akış davranışı (viskozitesi) için, yüksek moleküler ağırlıklı CMC’nin NFC miktarına kıyasla daha yüksek miktarda kullanılması ile kesme ve inceltme açısından da fayda sağlayacaktır.

Baskı aşamasına geçmeden önce baskı parametrelerinin ayarlanması gerekmektedir. Özellikle ortamın sıcaklığı 22°C–24°C arasında tutulmalıdır.¹ Sabit bir reolojik özellikte ve güvenilir bir baskı için optimum performans için mürekkep 6°C–8°C sıcaklıkta saklanmalıdır.¹ Ayrıca istenen iskele tasarımı da yazılım uygulamaları kullanılarak tasarlanmalıdır. Bu gibi noktalara dikkat ederek kaliteli bir iskele imalatı elde etmiş olunacaktır. Ardından şırınga baskı makinesine sabitlenir. Ortam koşulları da kontrol edildikten sonra iskele basılır. Basılan iskele -25°C’de kurutulur. Ardından aynı sıcaklıkta dondurarak kurutma işlemi (kriyojenik kurutma yani liyofilizasyon) gerçekleştirir. Bu aşamanın amacı, iskeledeki serbest suyun uzaklaştırarak iskelenin gözenek morfolojisinin stabilitesini korumaktır. Ardından 3D yazdırılmış iskeleyi dehidrotermal (DHT) işlemle çapraz bağlaması yapılır. Bu işlem 120°C sıcaklık ve 100 mbr basınç altında vakumlu fırında yapılır. Bu adımın yapılma sebebi, iskelenin termodinamiksel özelliklerinin artırılması ile CMC ve NFC’nin fonksiyonel gruplarını CA’nın da etkisi ile çapraz bağ ağları oluşturmaya teşvik etmektir. Son adım olarak iskelenin nötralize edilmesi gerekmektedir. Bu aşamanın amacı ise iskeledeki fazla CA’nın alkali bir çözeltide nötralize edilmesi ile in vitro hücre testleri yapılacağı zaman beklenmedik hücresel davranışlar göstermesini önlemektir. Nötralizasyon 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisi ile yapılır. İskele çözelti içerisinde çalkama işlemine maruz bırakılır ardından saf su ile yıkaması gerçekleşir ve 24 saat hava ile kurutmaya konur. Nötralizasyonun süresi ve çözeltinin iyi karışması ve çalkalama hareketi kontrollü olmalıdır aksi takdirde iskele üzerine yüksek sitotoksik özellikler gibi istenmeyen durumlar  oluşturabilir.¹

Başarılı bir optimizasyon doğrultusunda araştırmacılar yaptıkları iskele üzerinde ilk hücre kültürleme deneylerini başarı ile gerçekleşmiştir. Malzemenin sitotoksik olmadığı ve mekanik olarak stabil olduğu doğrulanmıştır.² İskele üzerindeki deri hücrelerinin 2-3 hafta arası hayatta kaldığı ve deri dokusu da geliştirdiği yapılan deneyler sonucu ispatlanmıştır. Araştırmacıların şimdiki hedefi ise hidrojel formülasyonunu daha da iyi bir şekilde optimize ederek yeni deneylerde kullanmaktır. Özellikle hayvan deneylerinin yoğun olarak kullanıldığı sektörler hedeflenmektedir.²

Biyomimetik (biyotaklit) bakış açısı ile oluşturulan bu yapay deriler tıp ve mühendislik alanında bir basamak daha ileriye gidilmesini sağlamıştır. Bu gelişme bir yandan biyomühendislik ve doku mühendisliği alanlarına yapılan yatırımların daha da artacağını göstermektedir. Söz konusu araştırma organ kayıpları için bir çıkış yolu olarak gözükmektedir. Bu sebeple üç boyutlu biyo yazıcılardan doku elde edilme teknolojisinin yakın bir gelecekte başlayacağı söylenebilir. Bir yandan da deney hayvanlarının etik değerler dışında kullanılmasının ve kullanılmamasının sürdürülebilir olması için yapılan bu çalışmalar en makul yol olarak gözükmektedir.

Kaynaklar

1. Müller, M., & Dufresne, A. (2024). Protocol for the fabrication of self-standing (nano)cellulose-based 3D scaffolds for in vitro testing of skin and cartilage cells. STAR Protocols, 5(3), 102748 https://doi.org/10.1016/j.xpro.2024.102748 
2. https://phys.org/news/2025-04-3d-skin-imitation-equipped-cells.html